新型冠状病毒(2019-nCoV)结构及感染宿主细胞机制

2020/02/03

一、冠状病毒

        2003年,一场由SARS病毒引起的疫情,使得"冠状病毒"这个名词逐渐走进了人们的视野。冠状病毒因其在显微镜下能观察到明显的棒状粒子凸起,形状好似中世纪欧洲帝王的皇冠而得名。1975年,病毒命名委员会正式命名了冠状病毒科。根据病毒的血清学特点和核苷酸序列的差异,冠状病毒科又分为冠状病毒和环曲病毒两个属。  

        冠状病毒是一种具有包膜的RNA病毒,广泛存在于人类、哺乳动物和鸟类宿主中,可引发呼吸道、肠道、肝脏和神经系统疾病。目前已知有6个冠状病毒可感染人类,其中229E、OC43、NL63和HKU1可以导致普通感冒症状;另外两种病毒:严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)和中东呼吸综合征病毒(MERS-CoV)是人畜共患病毒,可导致致命疾病。基于冠状病毒的高流行性和广泛分布,其基因组的巨大遗传多样性和频繁重组,人与动物间接触活动的增加,加之频繁的跨物种感染和偶尔的动物传人事件,新的冠状病毒可能会周期性地出现。

        冠状病毒粒子形状并不规则,直径约60-220nm。病毒具有包膜结构,上面有三种蛋白:刺突糖蛋白(S,Spike Protein)、小包膜糖蛋白(E,Envelope Protein)和膜糖蛋白(M,Membrane Protein),少数种类还有血凝素糖蛋白(HE蛋白,Haemaglutinin-esterase)。S蛋白在识别并结合宿主细胞表面受体,并介导病毒包膜与细胞膜融合的过程中起到关键性作用;M蛋白则参与了病毒包膜的形成与出芽过程;HE蛋白则是构成包膜的短凸起,可能与冠状病毒早期吸附有关,某些冠状病毒的HE蛋白可引起红细胞的凝集以及对红细胞的吸附。

        冠状病毒其特点是可以以自身为模板,指导合成病毒相关蛋白质。病毒进入宿主细胞后,首先以病毒RNA为模板表达出RNA聚合酶,随后RNA聚合酶完成负链RNA的转录合成、各种结构蛋白mRNA的合成,以及病毒基因组RNA的复制。

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二、2019-nCoV

        2019年12月,中国武汉发现一批与海鲜批发市场相关的不明原因导致的肺炎患者。通过全基因组测序检测出一种新型冠状病毒。该病毒属于Sarbe病毒亚属,正冠状病毒亚科,该病毒与MERS-CoV和SARS-CoV不同,它成为可以感染人类的冠状病毒科中的第七个成员。

1、病毒形态

        负染法电镜下观察病毒,病毒一般呈球形,但有些呈多形性(见下图)。直径在60-140nm之间。病毒颗粒有明显的棘突,大约9-12nm, 导致病毒呈现了日冕状。在人气道上皮超薄切片中发现了胞外游离病毒颗粒和胞质膜囊内充满病毒颗粒的包涵体。观察到的这一形态与冠状病毒科一致。

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        上海科技大学免疫化学研究所和中国科学院上海药物研究所抗2019-nCoV冠状病毒感染联合应急攻关团队宣布:上海科技大学饶子和/杨海涛课题组已测定新型冠状病毒3CL水解酶(Mpro)高分率晶体结构,以便有更多的科技工作者、特别是药物研发的科技人员使用。

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2、病毒核酸序列

        2020年1月,新英格兰杂志发表了一篇关于一种在中国武汉发生的新型肺炎的报道,研究者从3名患者肺泡灌洗液中分别获得了2个全长的冠状病毒序列,1位患者体内分离到的病毒全长基因序列。且86.9%核酸序列与之前报道过的蝙蝠体内分离到的SARS样冠状病毒(bat-SL-CoVZC45, MG772933.1)有高度一致性。

1、BetaCoV/Wuhan/IVDC-HB-01/2019, 

accession ID: EPI_ISL_402119; 

2、BetaCoV/Wuhan/IVDC-HB-04/2020, 

accession ID: EPI_ISL_402120; 

3、BetaCoV/Wuhan/IVDC-HB-05/2019, 

accession ID: EPI_ISL_402121)。这3个新型冠状病毒全基因组序列已经上报给GASAID组织。

        这3个新型冠状病毒基因汇总形成了Sarbe冠状病毒亚属中的独立分枝,显示了典型的乙型冠状病毒属结构:一个5′非翻译区(UTR)、复制酶复合物(orf1ab)、S基因、E基因、M基因、N基因、3′UTR和几个未识别的非结构开放读码框。

        尽管2019-nCov与蝙蝠体内分离到的乙型冠状病毒相似,但是与SARS冠状病毒和MERS冠状病毒有明显不同。这3份来自武汉的2019新型冠状病毒与2份来自蝙蝠体内的SARS样病毒株ZC45,ZXC21 形成了Sarbe 冠状病毒亚属B谱系中一个新的分枝;来自人体的SARS冠状病毒则与中国西南部蝙蝠体内分离到SARS样冠状病毒共同形成了Sarbe冠状病毒亚属的另外一个分枝。2019-nCoV和b-冠状病毒在保守区域复制酶(ORF 1ab)序列一致性方面没有达到90%,因此2019年武汉病毒性肺炎的可能病原体2019-nCov是一种新型乙型冠状病毒,属于冠状病毒科中的Sarbe冠状病毒亚属。

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        石正丽团队研究了7例早期重症病患,6例来自华南海鲜市场,包括5名男性患者和2名女性患者,平均年龄为47岁[3]。发病时间区间为2019年12月12日至2019年12月23日。研究结果显示:7个被鉴定和测序出的非结构性蛋白也存在于SARS冠状病毒中。意味着新冠病毒与SARS紧密相关,这也是新冠病毒被命名为2019-nCoV的主要原因。更直接的证据是:在5名病人身上,获取了全长度基因组序列,发现彼此之间相似度超过99.9%,与SARS冠状病毒有79.5%的序列一致。此外,还发现该病毒序列与一种蝙蝠冠状病毒在全基因组水平上相似度高达96%。这表明蝙蝠可能是该冠状病毒的来源。该研究发表在2020年2月3日在Nature上在线发表。

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        同一时间,复旦张永振团队的研究,结论佐证了石正丽团队的结果。研究人员对患者的支气管肺泡灌洗液(肺分泌物)样品进行了基因组测序,从中鉴定出了一种冠状病毒科的新型RNA病毒。对新型冠状病毒的完整基因组(29,903个核苷酸)进行了系统进化分析,认为该病毒与一组来自于蝙蝠的SARS样冠状病毒核苷酸相似性达89.1%,亲缘关系最为密切。研究结果也发表在2020年2月3日的Nature上。

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        不过,虽然新冠病毒与蝙蝠冠状病毒显示出了密切相关性,甚至在nsp7和E蛋白中显示出与Bat-SL-CoVZC45 100%的氨基酸相似性,但论文仍指出,需要更多的工作来确定病毒的天然宿主和中间宿主。

3、感染宿主细胞机制

        为了解武汉新型冠状病毒与已知明确感染人的两种冠状病毒的关系,此论文的研究者通过对武汉新型冠状病毒基因组与2002年“非典”SARS冠状病毒、“中东呼吸综合征”MERS冠状病毒进行了全基因组比对,发现平均分别有70%和~40%的序列相似性。其中不同冠状病毒与宿主细胞作用的关键spike基因(编码S-蛋白),有更大的差异性。

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        SARS病毒的S-蛋白和MERS病毒S-蛋白分别通过与人的ACE2蛋白或DPP4蛋白互作结合来感染人的呼吸道上皮细胞。作者首先比较了武汉冠状病毒与SARS和MERS病毒S-蛋白的宿主受体互作区(RBD区),发现在RBD区域中,武汉冠状病毒与SARS病毒比较相似,但与MERS病毒差异很大,所以排除了S-蛋白与DPP4互作感染人的可能。但是,武汉冠状病毒S-蛋白与人ACE2互作也存在很大困难-已经证明的SARS病毒S-蛋白与ACE2互作的5个关键氨基酸,在武汉冠状病毒中有4个发生了改变。

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        为了分析清楚这个问题,研究者利用分子结构模拟的计算方法,对武汉冠状病毒S-蛋白和人ACE2蛋白进行了结构对接研究,获得了令人惊讶的结果。虽然武汉冠状病毒S-蛋白中与ACE2蛋白结合的5个关键氨基酸有4个发生了变化,但变化后的氨基酸,却整体性上非常完美的维持了SARS病毒S-蛋白与ACE2蛋白互作的原结构构象。尽管武汉新型冠状病毒的新结构与ACE2蛋白互作能力,由于丢失的少数氢键有所下降(相比SARS病毒S-蛋白与ACE2的作用有下降),但仍然达到很强的结合自由能(-50.6 kcal/mol)。这一结果说明武汉冠状病毒是通过S-蛋白与人ACE2互作的分子机制,来感染人的呼吸道上皮细胞。

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        石正丽团队对表达或不表达ACE2蛋白的人类、马蹄蝠、麝香猫、猪和小鼠Hela细胞进行了病毒感染研究。

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        结果显示:除了小鼠ACE2,在其他细胞中,2019-nCoV都选择了ACE2作为进入细胞的受体。于是石正丽团队指出,最有可能的病毒传播途径是通过个体的呼吸道,但也不排除其他传播的可能性,仍需要更多的患者数据来进一步研究传播途径。

张永振团队的研究结果[4]同样指出,由于新型冠状病毒和SARS-CoV RBD结构域之间的氨基酸序列和预测的蛋白质结构具有高度相似性,新冠病毒可以有效利用ACE2(血管紧张素转化酶2)作为细胞侵入受体,从而可能促进人与人之间的传播。

4、2019-nCoV感染宿主细胞过程

        病毒要进入细胞,细胞上就必须要有它对应的受体,比如艾滋病病毒HIV的常见受体是CD4蛋白,通常在血液里免疫细胞的表面,所以HIV可以通过血液传播,而不用担心空气传播。而这次新型冠状病毒的受体和SARS一样,都是血管紧张素转化酶2,这意味着病毒要感染人类首先得接触到有这种酶的细胞,完成受体结合。而我们恰好有不少这种细胞就暴露在空气中:黏膜。黏膜的意义在于分泌黏液,保持湿润,我们的嘴唇、眼皮、鼻腔和口腔里都有大量的黏膜细胞,当病毒以某种方式接触到口腔黏膜,与受体结合,感染就开始了。

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        首先,新冠状病毒的包膜会与细胞膜融合,释放病毒遗传物质——一段RNA单链,这种RNA可以作为信使RNA,骗过细胞里的核糖体,合成RNA复制酶,RNA复制酶会根据病毒RNA生成RNA负链,这条RNA负链会继续和复制酶生成更多的RNA片段和RNA正链,这些不同的RNA片段又会和核糖体生成更多不同的病毒蛋白质结构,最后这些蛋白外壳会和RNA组合生成新的冠状病毒颗粒,通过高尔基体分泌至细胞外,感染新的细胞。每个被感染的细胞,都会产生成千上万的新病毒颗粒,蔓延到器官、支气管,最终到达肺泡,引发肺炎。




参考文献: 

1. Na Zhu, Ph.D., etal, A Novel Coronavirus from Patients with Pneumonia in China, NEJM, 2020.

2. Xintian, X., C. Ping, and H. Pei, Evolution of the novel coronavirus from the ongoing Wuhan outbreak and modeling of its spike for risk of human transmission. SCIENCE CHINA Life Sciences, 2020.

3. Zhengli Shi, etal. A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin, Nature, 2020.

4. Yongzhen Zhang, etal. A new coronavirus associated with human respiratory disease in China, Nature, 2020.


(该资料由昭衍新药整理汇总,图片来源于网络)



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